Questões Concurso USP

O protocolo de extração em fase sólida com colunas C18 após a digestão segue a ordem: 1) condicionamento da coluna, 2) adição da amostra, 3) lavagem com 100% solvente orgânico (acetonitrila ou metanol), e 4) eluição da amostra em solução aquosa acidificada.

A utilização de ditiotreitol (DTT), um agente redutor, tem o papel de prevenir a oxidação de aminoácidos suscetíveis, tais como a metionina.

A reprodutibilidade das análises depende de uma digestão completa, e, atualmente, a enzima tripsina (que perde sua atividade em pH<4) tem sido amplamente substituída pela pepsina, pois, nesse caso, a digestão já é realizada em pH ácido compatível com a posterior injeção no espectrômetro de massas dos peptídeos resultantes.

Desnaturantes caotrópicos, como a ureia, ou detergentes, como o dodecil-sulfato de sódio (SDS), são utilizados para solubilizar e desnaturar proteínas. A vantagem da utilização de ureia é que a enzima tripsina tolera altas concentrações (até 8 M) desse agente e, dessa forma, pode-se injetar o material digerido diretamente no espectrômetro de massas, evitando-se o passo adicional para remover detergentes.

Surfactantes estão comumente presentes nos tampões utilizados para a extração das proteínas dos tecidos, mas são incompatíveis com a análise por espectrometria de massas. Dispositivos como filtros de limite de peso molecular, filtros contendo membrana de borosilicato e micropartículas que imobilizam as proteínas por agregação têm sido utilizados para remover contaminantes indesejados.

Formas de interface para introdução de amostras no espectrômetro de massas utilizando-se a fonte eletrospray (ESI) são a cromatografia líquida, eletroforese em gel de poliacrilamida e eletroforese capilar. 

Após a detecção do íon precursor no modo varredura (MS1), para ser possível a detecção dos fragmentos de uma molécula (espectro de MS2), é necessário aumentar a voltagem da fonte de ionização para gerar fragmentos na fonte. 

Para a obtenção do íon molecular de compostos biológicos, pode-se utilizar ionização por elétrons (EI) e sua evolução, ionização por eletrospray (ESI), pois são métodos considerados brandos, não necessitam de derivatização e nem induzem a fragmentação das moléculas, além de ocorrerem a pressão atmosférica. 

Moléculas neutras precisam ser ionizadas no analisador de massas para serem detectadas.

A fonte de ionização do tipo MALDI produz íons com poucas cargas (geralmente 1 ou 2), necessitando de um detector capaz de monitorar um intervalo de massas maior para detecção de moléculas com massa alta.

A HRMS é utilizada principalmente em análises proteômicas, pois as demais abordagens ômicas não requerem alta resolução para diferenciar biomoléculas em amostras biológicas complexas.

A metabolômica e a lipidômica utilizam espectrometria de massas de baixa resolução, pois a diferenciação de metabólitos e lipídeos pode ser realizada apenas com base no tempo de retenção cromatográfico.

A espectrometria de massas de alta resolução não é adequada para análises ômicas, pois exige tempos de aquisição muito longos, limitando sua aplicabilidade na identificação de biomoléculas.

A HRMS não contribui significativamente para a identificação estrutural de biomoléculas, sendo utilizada apenas para quantificação relativa de metabólitos e proteínas em amostras biológicas.

A HRMS permite a identificação precisa de biomoléculas em proteômica, metabolômica e lipidômica, diferenciando compostos isobáricos e fornecendo massa exata para elucidação estrutural.

A análise MS/MS tem como principal finalidade fornecer a massa exata do composto de interesse, sem a necessidade de estudar padrões de fragmentação ou realizar experimentos adicionais para confirmação estrutural.

A técnica MS? é utilizada exclusivamente para análise de compostos voláteis, enquanto a espectrometria de massas em tandem (MS/MS) é aplicada apenas para biomoléculas de alto peso molecular, como proteínas e lipídeos.

As estratégias MS/MS e MS? não são aplicáveis para diferenciação de isômeros ou elucidação estrutural detalhada, sendo utilizadas apenas para identificação preliminar com base na massa do íon precursor.

O uso de espectrometria de massas de múltiplos estágios (MS?) não traz benefícios adicionais em relação à análise convencional de espectrometria de massas (MS), pois a fragmentação repetida dos íons não melhora a identificação de compostos complexos.

Os padrões internos devem ter propriedades químicas e físicas diferentes da molécula a ser quantificada, além de serem puros, ausentes na amostra e inertes em relação aos compostos presentes.

O padrão interno deve ser adicionado após a etapa de limpeza ou enriquecimento para evitar alterações na concentração do padrão durante o preparo da amostra.

Os padrões internos isotopicamente marcados corrigem erros relacionados a variações no processo de preparo da amostra, e no volume de injeção mas não corrigem as variações relacionadas a diferenças na ionização (efeito matriz).

Isótopos marcados do analito (isotopólogos) são os padrões internos ideais, pois possuem estrutura idêntica e diferem apenas na massa, garantindo eficiência de ionização e comportamento cromatográfico semelhantes.

Os padrões internos devem eluir em tempos de retenção distintos do analito para que a quantificação seja realizada de forma precisa e seletiva.