Sobre o preparo de amostras em proteômica bottom-up...

O protocolo de extração em fase sólida com colunas C18 após a digestão segue a ordem: 1) condicionamento da coluna, 2) adição da amostra, 3) lavagem com 100% solvente orgânico (acetonitrila ou metanol), e 4) eluição da amostra em solução aquosa acidificada.

A utilização de ditiotreitol (DTT), um agente redutor, tem o papel de prevenir a oxidação de aminoácidos suscetíveis, tais como a metionina.

A reprodutibilidade das análises depende de uma digestão completa, e, atualmente, a enzima tripsina (que perde sua atividade em pH<4) tem sido amplamente substituída pela pepsina, pois, nesse caso, a digestão já é realizada em pH ácido compatível com a posterior injeção no espectrômetro de massas dos peptídeos resultantes.

Desnaturantes caotrópicos, como a ureia, ou detergentes, como o dodecil-sulfato de sódio (SDS), são utilizados para solubilizar e desnaturar proteínas. A vantagem da utilização de ureia é que a enzima tripsina tolera altas concentrações (até 8 M) desse agente e, dessa forma, pode-se injetar o material digerido diretamente no espectrômetro de massas, evitando-se o passo adicional para remover detergentes.

Surfactantes estão comumente presentes nos tampões utilizados para a extração das proteínas dos tecidos, mas são incompatíveis com a análise por espectrometria de massas. Dispositivos como filtros de limite de peso molecular, filtros contendo membrana de borosilicato e micropartículas que imobilizam as proteínas por agregação têm sido utilizados para remover contaminantes indesejados.