Questões sobre Técnicas de Laboratório

A aferição da massa exata permite determinar a fórmula molecular e os grupos funcionais da molécula.

A determinação da sequência de um peptídeo pode ser obtida através da análise dos íons y e b (nomenclatura de Roepstorff-Fohlmann-Biemann) gerados após fragmentação.

Os fragmentos de um íon e suas intensidades são sempre constantes, independentemente da técnica de fragmentação utilizada.

A técnica de fragmentação do tipo dissociação por transferência de elétrons (ETD) é especialmente utilizada para determinar fragmentos do tipo b em peptídeos, mais difíceis de serem obtidos por dissociação induzida por colisão (CID) ou dissociação induzida por colisão de alta energia (HCD).

A espectrometria de massas de múltiplos estágios (MSn) é especialmente apropriada para se obter informações estruturais de uma molécula. A partir do segundo estágio de fragmentação, é necessária a ativação da fragmentação por colisão de alta energia (HCD).

No método de aquisição dependente de dados (do inglês, DDA), o instrumento alterna entre um espectro de varredura dos íons precursores que coeluem naquele tempo cromatográfico e a aquisição de espectros de fragmentação, onde o maior número possível de íons precursores é sequencialmente isolado e fragmentado.

No método de aquisição independente de dados (do inglês, DIA), todos os íons precursores em uma janela de m/z predeterminada são fragmentados ao mesmo tempo, o que leva a espectros de fragmentação (MS/MS) complexos, gerando muitos valores faltantes nas análises de dados.

Uma desvantagem do método de DIA em relação ao método de DDA é a necessidade do conhecimento prévio dos analitos de interesse. Entretanto, uma grande vantagem é a maior precisão na quantificação dos analitos.

O conhecimento prévio de uma lista de transições, incluindo íons precursores, bem como de seus fragmentos correspondentes é essencial para definir um experimento de quantificação direcionada (alvo, targeted, comumente chamado de monitoramento de reações em paralelo, do inglês, PRM) em instrumentos híbridos de alta resolução, tais como Q-TOF e Q-orbitrap.

Uma desvantagem de experimentos de quantificação direcionada (alvo, comumente chamado de monitoramento de reações em paralelo, do inglês, PRM) em relação a experimentos não direcionados é que existe a perda de sensibilidade devido aos passos sucessivos de filtro de massas (um para íons precursores e o outro para fragmentos).

A cromatografia em fase gasosa é comumente utilizada acoplada ao espectrômetro de massas para deteção de metabólitos. Como muitos metabólitos possuem baixo ponto de ebulição, é necessária uma etapa de derivatização para diminuir a sua volatilidade e permitir que possam ser analisados por GC-MS.

Na cromatografia líquida de alta eficiência utilizando fase reversa, os analitos hidrofóbicos eluem primeiro da coluna cromatográfica, seguidos por compostos polares e muito hidrofílicos.

Para a separação de compostos apolares, tais como lipídeos, utiliza-se comumente a técnica de cromatografia líquida de interação hidrofílica (HILIC), que é uma variação da antiga cromatografia de fase normal, que utilizava sílica como fase estacionária.

A utilização de espectrômetros de massas de alta resolução e acurácia tornou rotineira a análise direta de misturas de analitos sem uma etapa anterior de separação, uma vez que essa metodologia é rápida, de alta repetibilidade e com capacidade de identificar múltiplos isômeros em uma única análise.

A separação de um (ou mais) composto(s) de interesse de outros analitos presentes em matrizes complexas pode ser realizada por cromatografia multidimensional, em que uma ou mais etapas de separação cromatográfica diferentes são realizadas antes da análise por espectrometria de massas (offline), ou acopladas sequencialmente à deteção pelo espectrômetro de massas (online). Uma desvantagem da cromatografia multidimensional online é o maior tempo ocioso do espectrômetro de massas.

A fase móvel e a coluna cromatográfica determinam a eficiência da separação, enquanto os aditivos influenciam apenas a estabilidade da coluna, sem impacto na ionização dos compostos.

A interação entre os analitos e a fase estacionária da coluna é o principal fator na separação cromatográfica, tornando a composição da fase móvel e o uso de aditivos menos relevantes.

A escolha da fase móvel e dos aditivos pode modificar a ionização dos compostos, além de otimizar a separação cromatográfica e melhorar a sensibilidade de detecção dos analitos.

O uso de aditivos na fase móvel tem como principal função ajustar o pH da solução, sem impacto significativo na eficiência da separação cromatográfica ou na ionização dos analitos.

A separação cromatográfica em LC-MS depende exclusivamente da coluna cromatográfica utilizada, sendo desnecessária a escolha criteriosa da fase móvel ou o uso de aditivos na fase móvel.