Listagem de Questões sobre Geral
Dentre as estratégias de transformação genética de plantas, o sistema baseado na utilização da bactéria de solo Agrobacterium tumefaciens se destaca pela sua altaeficiência e relativa simplicidade. Na natureza esta bactéria apresenta um plasmídeo que contém todos os componentes necessários para o processo de transferência de DNA para a célula vegetal (plamídeo Ti). São essenciais para esse processo:
as bordas de repetição direta que flanqueiam o T-DNA e genes de resistência a antibióticos codificados pelo plasmídeo Ti;
os genes de virulência (genes VIR) e os genes de metabolismo de hormônios localizados na região a ser transferida;
genes de biossíntese de hormônios vegetais localizados na região a ser transferida e as proteínas de ligação a DNA codificadas por alguns dos genes de virulência;
as bordas de repetição direta que flanqueiam o T-DNA e os genes de virulência da região VIR.
A transformação genética de plantas efetuada pela bactéria de solo Agrobacterium tumefaciens é uma das técnicas mais utilizadas para a transferência de genes para o genoma vegetal. Além de sua utilização para aintrodução de genes de interesse agronômico, esta técnica também pode ser utilizada como uma estratégia para o isolamento e clonagem de genes vegetais, tais como a clonagem através de:
mapeamento;
seleção diferencial (screening diferencial);
bibliotecas subtrativas;
seleção com anticorpos (imuno-screening);
mutagênese insercional.
Trabalhando com o isolamento de um gene de trigo, um pesquisador desenvolveu duas estratégias de clonagem, utilizando como sonda um gene homólogo isolado de plantas de arroz. Na primeira delas, ele utilizou como material inicial o DNA extraído de culturas de células em suspensão de trigo, resultando na obtenção do clone A. Numa segunda abordagem, ele utilizou uma preparação de RNA mensageiro das mesmas células, resultando na obtenção do clone B.
Os clones obtidos serão utilizados para a realização de três experimentos:
Experimento 1 – caracterização dos elementos que regulam a expressão tecidual do gene.
Experimento 2 – expressão do gene em bactérias para purificação da proteína codificada pelo gene isolado.
Experimento 3 – isolamento de genes de proteínas que interagem com a proteína codificada pelo gene isolado através do sistema Duplo Híbrido em leveduras.
Os clones que serão utilizados, respectivamente, para cada um dos experimentos são:
clone A, clone B e clone A;
clone B, clone B e clone A;
clone A, clone B e clone B;
clone A, clone A e clone B;
clone B, clone A e clone B.
Os marcadores moleculares constituem uma importante ferramenta para a análise genômica, tendo apresentado um grande desenvolvimento nos últimos anos. Dentre as mais utilizadas, são consideradas de grande poder de resolução, tendo em vista que são marcadores co-dominantes, as técnicas de:
RAPD e RFLP;
AFLP e SSR;
SSR e AFLP;
RAPD e AFLP;
RFLP e SSR.
Em protocolos de seqüenciamento de DNA a introdução de 7-deaza-citidina é necessária sempre que a seqüência a ser determinada:
for maior do que 400 pares de base;
for rica em nucleotídeos G e C;
apresentar um conteúdo A/T maior que 70%;
estiver muito próxima ao oligonucleotídeo iniciador da síntese;
estiver sendo realizada através do método químico.
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